應(yīng)用專(zhuān)家 趙夢(mèng)路
 
抗體藥物在免疫、腫瘤治療等多種應(yīng)用中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，研究機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)到2025年抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到3000億美元[1]，下圖中紅色代表2018年使用量多的10種抗體藥物。

圖1 時(shí)間軸顯示從1975年開(kāi)始研發(fā)成功的治療性抗體及應(yīng)用

雖然抗體藥物市場(chǎng)巨大，但是每年通過(guò)FDA審核并成功上市的治療性抗體依然非常少，從下圖可以看出，上市藥物少的很大原因是治療性抗體藥物研發(fā)存在流程復(fù)雜、體外和體內(nèi)藥效驗(yàn)證困難等原因。

圖2 治療性抗體藥物臨床前研究路線

下圖可以看出傳統(tǒng)藥物篩選流程中沒(méi)有影像學(xué)方法，整個(gè)研發(fā)數(shù)據(jù)單一，必須拿到上一步的結(jié)果方可進(jìn)行下一步的研究。而影像學(xué)方法可以進(jìn)行高通量篩選，允許同時(shí)評(píng)估多個(gè)抗體分子的效力和毒性，關(guān)鍵一點(diǎn)是影像學(xué)方法在藥物篩選早期就可以拿到藥物有無(wú)毒性作用，可以預(yù)測(cè)藥物在人體的毒副作用，為更好的進(jìn)行臨床研究提供數(shù)據(jù)支持[2]。

圖3 藥物序列篩選和并行篩選

Leica THUNDER 3D極速高內(nèi)涵活細(xì)胞培養(yǎng)成像系統(tǒng)是Leica全新研發(fā)的寬場(chǎng)快速高分辨熒光成像系統(tǒng)，擁有成像速度快、分辨率高、應(yīng)用范圍廣、光毒性低和Navigator高通量采集與自動(dòng)化處理數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)。
 

優(yōu)勢(shì)一 成像速度快

適合高通量快速篩選，視頻中使用THUNDER拍攝96孔板，每孔三色熒光成像加10層 Z stack，終3.5分鐘即可全部采集完成。

視頻1 THUNDER快速多通道熒光數(shù)據(jù)采集

視頻2 THUNDER自定義采集參數(shù)和隨機(jī)性設(shè)置

高速多通道采集只是獲取數(shù)據(jù)的前期步驟，自動(dòng)化分析數(shù)據(jù)才能高效的獲取結(jié)果。THUNDER可在Navigator流程中添加自動(dòng)分析步驟，讓數(shù)據(jù)采集完成自動(dòng)進(jìn)入分析流程，終將結(jié)果直接呈現(xiàn)出來(lái)，

圖4 Navigator高通量采集后自動(dòng)進(jìn)入分析模塊

優(yōu)勢(shì)二 高分辨率

傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像雖然可以快速采集數(shù)據(jù)，但是由于固有的光學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)法有效濾除非焦信號(hào)造成的信號(hào)模糊、信噪比差，而點(diǎn)掃描共聚焦又受限于成像速度慢無(wú)法滿足高通量篩選的需求。THUNDER快速高分辨熒光成像系統(tǒng)，基于寬場(chǎng)成像一次拍照即可達(dá)到136nm的超高分辨率成像，THUNDER在滿足成像速度的同時(shí)具備高分辨率優(yōu)勢(shì)，超高分辨率和高信噪比圖像使后期結(jié)構(gòu)辨別、弱信號(hào)定量分析成為可能。

圖5 THUNDER分辨細(xì)胞核中的DNA損傷位點(diǎn)

傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡由于非焦信號(hào)干擾和衍射極限的限制，無(wú)法分辨300nm以內(nèi)距離較近的信號(hào)。圖5中的觀察病毒侵入細(xì)胞核中造成的損傷位點(diǎn)（黃色點(diǎn)信號(hào)），由于THUNDER在XY軸擁有136nm的超高分辨率，因此可以清楚分辨靠的比較近的損傷點(diǎn)，這一THUNDER圖像可以進(jìn)行更加準(zhǔn)確的定量分析。

圖6 神經(jīng)細(xì)胞離體3D培養(yǎng)

在藥物研究領(lǐng)域，經(jīng)常需要驗(yàn)證藥物分子對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及存活的影響。THUNDER圖像具有高分辨率優(yōu)勢(shì)，可以在藥物作用早期即可觀察到細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的改變，從而更靈敏的捕獲藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，為后期臨床研究提供數(shù)據(jù)支持。

圖7 高信噪比圖像助力細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

圖像模糊，信噪比不足一直都是圖像后期分析的難題，THUNDER技術(shù)在細(xì)胞高通量計(jì)數(shù)分析方面，擁有天然的優(yōu)勢(shì)，高分辨和高信噪比的圖像大大簡(jiǎn)化了后期分析難度，可以更方便的進(jìn)行自動(dòng)分析。
 

優(yōu)勢(shì)三 應(yīng)用廣，適用細(xì)胞和模式動(dòng)物

隨著技術(shù)的進(jìn)步，抗體藥物臨床前研究已經(jīng)不再局限在單細(xì)胞水平的療效驗(yàn)證，而是涌現(xiàn)出越來(lái)越多的新技術(shù)滲透到活性分子的篩選中。由于抗體藥物在離體細(xì)胞中的代謝與在體內(nèi)情況有很大不同，如何縮小作用環(huán)境的差距成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)，比如可以通過(guò)類(lèi)器官的構(gòu)建來(lái)研究和體內(nèi)相似的微環(huán)境及滲透屏障，可以在斑馬、魚(yú)線蟲(chóng)等模式動(dòng)物活體水平研究抗體藥物在體內(nèi)環(huán)境的靶向性等等。這樣一系列復(fù)雜的模型都需要一種觀察深度大、應(yīng)用范圍廣的成像技術(shù)，THUNDER恰好可以滿足這些需求。

視頻3 Pseudoislets （pancreatic beta cells）(pancreatic beta cMIN6 cells grown as pseudoislets ells). DAPI (blue), Insulin (Alexa488, green), membrane receptor (Alexa594, red), phalloidin (Alexa647, white).
Sample courtesy Dr. Rémy Bonnavion, MPI for Heart and Lung Research, Bad Nauheim

視頻中胰島類(lèi)器官由于具有三維立體結(jié)構(gòu)，所以熒光顯微鏡無(wú)法分辨胰島素分泌的具體情況，THUNDER高分辨成像解決了這一難題，同時(shí)THUNDER拍攝深度深的優(yōu)點(diǎn)也讓整個(gè)類(lèi)器官都可以清楚的觀察。

視頻4 Lung Organoid Mouse lung organoids derived from alveola stem and progenitor cells
20x Air through 1mm plastic bottom
Sample courtesy Dr. Pumaree Kanrai, MPI for Heart and Lung Research, Bad Nauheim (Germany).

肺類(lèi)器官是培養(yǎng)中普通塑料培養(yǎng)板中的樣本，從參數(shù)可以看出THUNDER成像不僅可以清楚分辨肺泡細(xì)胞的位置，而且使用厚底培養(yǎng)容器和長(zhǎng)工作距離物鏡不影響THUNDER高分辨拍攝，因此THUNDER可以拍攝幾乎所有培養(yǎng)容器，覆蓋單細(xì)胞到大體積類(lèi)器官樣本，具有非常廣泛的應(yīng)用范圍。

圖8 線蟲(chóng)模式動(dòng)物THUNDER成像

圖9 線蟲(chóng)體細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)分析

在模式動(dòng)物成像方面，THUNDER依然可以做到體細(xì)胞水平的成像，并且在大尺度深度采集后可以自動(dòng)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，方便評(píng)估藥物在體內(nèi)代謝和對(duì)體細(xì)胞的毒性作用。

總結(jié)

THUNDER是Leica的超高分辨、高信噪比快速熒光成像系統(tǒng)，可以覆蓋單細(xì)胞、組織、類(lèi)器官和活體動(dòng)物等大部分研究領(lǐng)域。由于THUNDER具有快速高分辨的特點(diǎn)，因此所以可助力抗體藥物臨床前研究，可應(yīng)用于治療性抗體藥物的體外細(xì)胞水平藥效篩選和體內(nèi)活性藥效驗(yàn)證等試驗(yàn)，可助力抗體藥物活性篩選、殺傷效果驗(yàn)證、早期細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)等方面研究。
針對(duì)抗體研究中細(xì)胞遇到的細(xì)胞、類(lèi)器官和活體模式動(dòng)物等樣本，THUNDER倒置平臺(tái)和體視鏡平臺(tái)可以完美的覆蓋。而在分子水平，由于傳統(tǒng)光學(xué)衍射限制，無(wú)法直接觀察分子間的結(jié)合及相互作用強(qiáng)弱，Leica FALCON可以提供FLIM-FRET方案，可以超越衍射極限限制，實(shí)現(xiàn)分子水平相互作用檢測(cè)。基于熒光壽命系統(tǒng)的FRET檢測(cè)不受熒光染色、漂白等強(qiáng)度因素影響，可以更加準(zhǔn)確的檢測(cè)分子間的相互作用。

參考文獻(xiàn)：
1. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Luet al. Journal of Biomedical Science(2020) 27:1 
2. Cellular imaging in drug discovery. NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY(2006)343:5