熒光壽命成像助力攻克癌癥熱點靶標——四鏈DNA結構

1953年，科學家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克發現了DNA分子的雙螺旋結構，遺傳學的研究進入到分子層次，人們可以更深層的了解遺傳信息的構成和傳遞途徑（圖1A）。近年，科學家在人類癌癥細胞中發現一種四重螺旋體DNA分子——G-四鏈體(G-quadruplex)。它是由富含串聯重復鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的高級結構。G-四分體(G-quartet)是四鏈體的結構單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環狀平面，兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四鏈體（圖1B）。
 
有研究表明，G-四鏈體更多的出現在癌細胞等快速分裂的細胞中，與癌基因的啟動子區域和DNA鏈的端粒區域相互作用。因此，G-四鏈體結構與DNA復制過程有著緊密聯系，對于細胞分裂和增殖非常關鍵^[1]。那么，通過靶向調控G-四鏈體結構將有望成為選擇性抑制癌細胞增殖的新途徑，G-四鏈體也成為了癌癥治療藥物的重要靶標。

圖1.A：James Dewey Waston（左）& Francis Harry Compton Crick（右）

B：G4-DNA的3D結構
鑒于G4-DNA參與到很多生物過程當中，開發用于檢測和可視化細胞中 G4-DNA 結構的工具也尤為重要。倫敦帝國理工學院的研究人員開發了一種能夠在活細胞中檢測G4-DNA的熒光探針——DAOTA-M2，為人們揭開了這種結構的神秘面紗 ^[2]。
 
這種探針具備良好的活細胞滲透性和低細胞毒性，在與G4-DNA結合時會發出熒光，可以用來觀察G4-DNA是如何與活細胞內的其他分子相互作用的。并且當DAOTA-M2與不同的核酸拓撲結構結合時，將顯示出不同的熒光壽命信息，進而可以非常精準的區別雙螺旋DNA和G4 DNA（圖2），因為與四鏈體結合時熒光壽命更長（圖3）。

圖2. 熒光壽命置換測定的示意圖：競爭對手結合后，DAOTA-M2 從 G4-DNA 轉移到 dsDNA環境，導致其熒光壽命縮短


圖3 DAOTA-M2染色的活細胞U2OS細胞核DNA的FLIM分析（a）以 512 × 512 分辨率（λex=477 nm，λem=550–700 nm）記錄的熒光強度圖像，紅線表示用于 FLIM 分析的核分割（b） 來自 a 的 FLIM 圖，顯示在平均壽命 (τw) 9ns（紅色）和 13ns（藍色）之間（c） 平均核強度與平均核壽命（藍點）的二維相關性（d）單個原子核的放大 FLIM 圖 - 顏色代表壽命，由 9ns（紅色）和 13ns（藍色）之間的顏色梯度條定義

G4-DNA的生物功能是通過動態的折疊和打開實現。在細胞內，G4-DNA可以自發折疊，但其打開是由專門的解旋酶來完成。并且在接下來的研究中，科學家發現哺乳類動物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表達量減少將會導致DAOTA-M2熒光壽命變長（圖4）^[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2熒光壽命的變化監測G4-DNA在活細胞中的動態變化。

圖4，減少 FancJ或RTEL1 解旋酶表達如何導致更長的 DAOTA-M2 壽命 (τw)的示意圖
G4-DNA被認為是潛在癌癥治療藥物靶點，因此評估給定的 G4-DNA靶向藥物與該結構結合的能力將非常有用。通過不同處理后DAOTA-M2的熒光壽命變化，結果顯示雙羧酸功能化的Ni（Ni-salphen）與G4-DNA有很強的靶向結合能力，會在短時間內導致DAOTA-M2熒光壽命迅速下降。（圖5）

圖5. 加入結合劑1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像結果（顯示在 6ns（紅色）和 14ns（藍色）之間）共孵育后 使用 DMSO（對照）、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺：20 μm

在以上的科研工作中，不難發現，精準的檢測方法是必須的，比如貫穿于整篇文獻中的FLIM技術。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，熒光壽命成像）：是一種基于熒光壽命的顯微成像技術，其成像結果提供像素位點的壽命信息，使得我們在熒光強度成像之外，能更加深入地對樣品進行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強度成像的眾多優點，如不受熒光物質濃度、光漂白、激發光強度等因素的影響。會因為分子構象、分子間相互作用、分子微環境、生理狀態等條件改變而發生變化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON熒光壽命成像系統，搭載新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高靈敏度專用檢測器，提供超快速、多維度熒光壽命成像解決方案。
 
將特異性探針與FLIM相結合使用，不僅可以用來監測活細胞細胞核中G4-DNA的形成，以及判定小分子藥物與G4-DNA的相互作用，還可以應用于G4-DNA靶向藥物的篩選。這些信息將為癌癥的診斷和治療帶來了新啟示，更有助于靶向性新療法新藥物的開發。

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